🧬今天是2021年6月20日🧬

森言森语 考《分子生物学》前的一点零碎时间，就顺便写一点东西，写什么呢？ 前几个月，其实有个有趣的，或许也有意义的想法，但是困于文献积累还不够，技能掌握还不足，目前难以实现，所以就先来写篇小小前奏。用早上考《自然辩证法概论》的说法，就是认知的深入会促进技能的进步，技能的进步也会反过来加速认知。哈哈…… 今天的主题是：贯穿基因功能研究始终的分子生物学实验原理（特指植物基因功能研究） 为什么要写这个主题呢？是因为分子生物学实验相对来说，总是简单的，相对于什么，每个人都会有不同的参照。曾有人说，生物学的实验，基本上鸡鸭猫狗都可以做的很好，既然鸡鸭猫狗都可以做的很好，那我们就尽量一次做好，相对少花时间。 这时候，从逻辑上熟知生物学实验蕴含的历史背景，并融汇贯通生物学实验背后的原理，就显得难得。

贯穿植物基因功能研究始终的分子生物学实验原理 导读 由于我本科阶段基本上未深入涉及基因功能研究相关的生物学实验，唯一接触的就是PCR，更具体一点说是AS-PCR。所以在研究生阶段进入实验室之前和之后的一段时间里，我也从旁人那里听说，再加上本科阶段实验室的课题内容，大概明白一个共同点，即多数实验室都在开展基因功能研究相关的课题。

由于那个时候对创新有一种误解，所以当时一刀切认为做基因功能研究只是横向扩展，并未向纵深探索，没过多久，我就发现这种观点过于肤浅。因为近代以来，尤其21世纪以来，很多科学家都称21世纪为“生物学的时代”，而生物学部分领域的研究目前也正经历着基因功能研究这一阶段，也是不可跳跃的一个重要阶段。所以说多数课题组研究基因功能不是不创新，而是正在生物学整体往前推进的过程中积累更多坚实的证据，以打通基因功能在生物中庞杂的脉络。

提出问题 既然有上述的考虑，不论成熟与否，都要首先面临这些问题，你做这个基因功能的研究，他做那个基因功能的研究，那我做什么？这些基因是如何被研究者锁定，成为自己的研究对象？做这些基因会有哪些生物学意义？值不值的做？

后来，大家基本上有一个共识，那就是实验最终的结局基本上从一开始是就决定了，是谁决定的呢？也就是你最开始确定的那几个基因。因为硕博士阶段每个人都只有有限的时间来做充满未知的实验，这显然是有风险的，一般来说，不允许反悔。

这样的话，就要确保自己压中的基因务必对得起自己将来的付出与努力。哈哈，开个玩笑…… 于是，提出一个问题：如何确定候选基因？ 这是我上研究生之前对我自己提出的第一个问题，后面所有贯穿植物基因功能研究始终的分子生物学实验原理也都从这一问题出发。

如何确定候选基因 这个问题就很难回答，因为基因的来源有很多，通过各种各样的方式都可以确定一些值得尝试的基因。有正向的，有反向的。这里只简单说关于寻找同源蛋白，众所周知Arabidopsis thaliana的研究几乎引领了生物学的发展，很多重要的信号通路，基因功能的解析大都是从Arabidopsis thaliana率先报道，很多经典的文章也都是在Arabidopsis thaliana上做的，因此依据Arabidopsis thaliana的研究成果，就可以找一些与自己的研究方向相关的同源蛋白开展研究。近十几年来，随着各个物种的基因组相继公布，寻找同源蛋白就显得容易且快。我在最初的推文中详细写过关于同源蛋白的搜寻及基因家族成员鉴定。这里简单罗列基本的原理和步骤：

1.下载Arabidopsis thaliana感兴趣基因的核苷酸序列或蛋白序列 这里需要对interest基因有一个基本的了解，比如属于哪个基因家族？大致行使怎样的生物学功能？序列特征？在Arabidopsis thaliana中的数量等？

2.通过本地blast比对要自己的研究对象（比如Triticum aestivum） 这里最好确定在Triticum aestivum中的全部家族成员，通过常规的分析对Triticum aestivum中interest蛋白的同源蛋白做一个系统分析和了解。 由于这部分不是今天的主要内容，就不展开说了。还是抓紧时间开始铺天盖地做实验吧。 可以参考：基因家族成员鉴定的详细步骤

基因克隆 克隆到目的基因是首要任务，只有拿到基因，才能开干！ 基因的克隆需要PCR反应实现，而PCR的原理实际上就是NDA的复制，即半保留复制。 这里的模板通常说的是mRNA反转录产生的cDNA，有时也用基因组DNA。

PCR原理 PCR时，只要在试管内加入模板DNA、PCR引物、dNTPs（四种核苷酸）及适当浓度的Mg2+,DNA聚合酶就能在很短时间内将目标序列扩增100万倍以上。双链模板DNA分子首先在高温下解开成单链（氢键断裂），解链后，降低温度使短链引物分子立即与该模板DNA的特定序列结合，DNA聚合酶从引物处开始复制合成其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。在后续的反应中，其实模板和经复制的杂合DNA双链，都在下一轮循环的高温下解开为单链，再度复制模板DNA。 这里关于引物的设计其实没啥说的，头尾各取适当长度的序列作为F和R即可，如果不行，就调整长度多试几次问题不大。

Tips：2^30=1 073 741 824，所以通常来说30个cycles完全足够！

可以参考：PCR相关的细节;引物设计相关的细节

琼脂糖凝胶电泳 PCR反应结束后，需要通过琼脂糖凝胶电泳的检测。

琼脂糖凝胶电泳的原理 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是:它兼有"分子筛"和"电泳"的双重作用。 琼脂糖凝胶具有网络结构，分子通过时会受到阻力，大分子物质受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小。 DNA 在碱性条件下（缓冲液pH8.0）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率也不同。核酸染料可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带。

可以参考：琼脂糖凝胶电泳的相关细节

载体构建 拿到目的基因后，构建各种载体就是顺其自然的事情了。比如后面可能要筛库，筛库之后要验证与目的基因互作情况。

载体构建的原理 原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

可以参考：载体构建的相关细节

筛库和酵母双杂交实验 筛库与酵母双杂交实验的原理是一个道理。 酵母双杂交技术最初由Fields等人在研究酵母转录因子GAL4性质时建立，后续经过不断改进已发展成为一种成熟的protein-protein互作研究技术，被广泛应用于互作蛋白的筛选、蛋白互作的鉴定和验证、蛋白互作机理的探究、蛋白连锁图谱绘制等工作。

酵母双杂交的原理 Yeast two-hybrid system的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。酵母起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如，GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域，分别是位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD）和位于C端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain，AD)。DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因（GAL4-responsivegene）的上游激活序列(Upstreamactivating sequence， UAS)，并与之结合。而AD则是通过与转录机构（transcription machinery）中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录。DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 在酵母双杂交系统中，“诱饵”（bait）蛋白X构建至DNA-BD载体中，表达DNA-BD/X融合蛋白；“猎物”（prey）蛋白（待测试蛋白Y）构建至AD载体中，表达AD/Y融合蛋白。 如果bait和prey之间没有相互作用，BD和AD就不会与激活序列结合，报告基因也就不能被激活和表达；反之如果在酵母内，bait和prey相互作用且表达了，那么BD和AD就会与激活序列结合，下游报告基因（抗性筛选、蓝白斑筛选、营养缺陷型筛选等）也就被激活并进行表达。 故，bait和prey是否发生相互作用，即可通过对报告基因的激活表达与否进行检测。

Tips：酵母筛库的原理与酵母双杂交是一个道理。

可以参考：酵母双杂交相关细节；膜系统酵母双杂交相关细节

荧光素酶互补（Luc）实验 在验证植物蛋白互作时，荧光素酶互补实验 (Luciferase Complementation Assay, LCA) 因其高灵敏度、可定量化、操作简单高效被广泛应用于植物学和动物学蛋白质互作研究。

荧光素酶互补实验的原理 目前, 应用最为广泛的荧火素酶基因来源于北美萤火虫 (firefly luciferase), 该基因编码550个氨基酸组成的荧火素酶蛋白 (大小为62 kDa)。其可与对应的底物发生氧化作用产生生物荧光，产生的荧光值即表示两种酶的表达量多少。 实验中, 荧光素酶蛋白被切成N端和C端2个功能片段, 即NLuc (2–416AA)和 CLuc (398–550AA)。 在一个实验体系中, 待检测的2个目标蛋白分别与NLuc和CLuc融合, 如果2个目标蛋白相互作用, 则荧火素酶的NLuc和CLuc在空间上会足够靠近并正确组装, 从而发挥荧火素酶活性, 即分解底物产生荧光 。

可以参考：荧光素酶互补实验的相关细节

原核表达系统 下面的几个实验，就需要表达蛋白了。

原核表达的基本原理 是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。其本质的原理在于IPTG等诱导剂的诱导表达原理。 而常用的原核表达载体根据启动子及操纵位点序列不同分为三类： lac/Tac表达系统，PR/PL表达系统（是以噬菌体早期转录启动子PL、PR构建的载体）和T7表达系统（强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA聚合酶）。

可以参考：原核表达系统相关的细节

Western blot 蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 蛋白质印迹法是由瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所（Friedrich Miescher Institute）的Harry Towbin在1979年提出的。在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。 现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

Western Blot的原理 Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体PVDF或NC膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

可以参考：Western blot相关的细节

Pull down pull down实验又被称为蛋白质体外结合实验（binding assay in vitro），是一种验证酵母双杂交系统的体外试验技术。但是随着荧光素酶互补实验的发展，Pull down好像慢慢被摒弃。 1988年，Smith等人利用GST融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。 此后，GST pull down作为体外检测蛋白相互作用的常用方法被广泛使用，可验证已知蛋白之间的互作，也可用于筛选与已知蛋白互作的未知蛋白。

GST-pull down的原理 GST-pull down利用GST（谷胱甘肽巯基转移酶，glutathione S transferase，GST） 对GTH（谷胱甘肽，Glutathione，GTH）的亲和性，将bait-GST融合蛋白亲和固化在GTH磁珠上（bait-GST融合蛋白通过GST与固化在磁珠上的GTH结合结合），当目的蛋白溶液过柱孵育时，可从中捕获与之相互作用的prey，洗脱结合物之后可通过SDS-PAGE或Western blot分析，从而证实两种蛋白的相互作用或筛选prey。

Tips：bait和prey可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统及体外转录翻译系统等方法获得。

可以参考：Pull down相关的细节；蛋白电泳相关的细节

免疫共沉淀（Co-IP) CO-IP，又叫免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation），是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。 与其它研究蛋白质相互作用的方法相比，免疫共沉淀是在生理条件下检测蛋白质间相互作用，因此，不仅可以检测到体内形成的天然复合体，而且可排除过表达靶蛋白所带来的假阳性；由于内源性的靶蛋白是完全加工、修饰成熟的蛋白质，因此，依赖于修饰的蛋白质间相互作用也可以被检测到。

Co-IP的原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质（bait-prey，可能不只2个蛋白）相互作用被保留了下来，假如细胞内存在bait-prey蛋白复合物，用bait的抗体免疫沉淀bait，那么与bait在体内结合的蛋白质prey也被沉淀下来。因此在细胞裂解液中加入bait的抗体沉淀蛋白bait，随后利用蛋白印迹(western blot，WB)检测沉淀中是否存在蛋白prey，如果存在，则说明细胞内存在bait-prey蛋白复合物，即蛋白bait-prey存在相互作用。

可以参考：Co-IP相关的细节

绘图制表 实验做得差不多了，就应该顺手把图做好。关于作图制表，没什么可说的，我之前写过几篇关于作图相关的推文。 可以参考：关于作图