关于原核表达，让我一直不得其解的在于，为什么每次诱导需要加IPTG，IPTG是什么？ 为什么IPTG可以诱导基因的表达？今天就来学习一下原核表达相关的内容。 原核表达基本原理 是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法， 使其在特定原核生物或细胞内表达。其本质的原理在于IPTG等诱导剂的诱导表达原理。 而常用的原核表达载体根据启动子及操纵位点序列不同分为三类： lac/Tac表达系统，PR/PL表达系统（是以噬菌体早期转录启动子PL、PR构建的载体）和T7表达系统（强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA聚合酶）。 lac/Tac表达系统 （IPTG诱导原核表达原理） 乳糖操纵子（lac operon） 乳糖操纵子是参与乳糖分解的一个基因群，由乳糖系统的阻遏物和操纵序列组成，使得一组与乳糖代谢相关的基因受到同步的调控。 1961年雅各布（F．Jacob）和莫诺德（J．Monod）根据对该系统的研究而提出了著名的操纵子学说。 在大肠杆菌的乳糖系统操纵子中，β-半乳糖苷酶，半乳糖苷渗透酶，半乳糖苷转酰酶的结构基因以LacZ（z）， Lac Y（y），Lac A（a） 的顺序分别排列在质粒上，在z的上游有操纵序列Lac O（o），更前面有启动子Lac P（p），这就是乳糖操纵子的结构模式。 编码乳糖操纵系统中阻遏物的调节基因Lac I（i）位于和p上游的邻近位置。 ！ Z，Y，A基因产物由同一条多顺反子mRNA所编码，是结构基因。 ①Z、Y、A是指结构基因，用于表达性状； lacZ编码β-半乳糖苷酶，可以切断乳糖的半乳糖苷键，而产生半乳糖和葡萄糖； lacY编码β-半乳糖苷透性酶，构成转运系统，将半乳糖苷运入到细胞中； lacA编码β-半乳糖苷乙酰转移酶，只将乙酰-辅酶A上的乙酰基转移到β-半乳糖苷上； ②I是指调节基因，调节分泌阻遏物或诱导物； ③O是指操纵基因，与阻遏蛋白的结合部位，不编码任何蛋白； ④P是指启动子，RNA聚合酶与其识别并结合，启动基因的转录和翻译，但其本身不能转录成mRNA。 ！ 当阻遏物与操纵区O相结合时，lac mRNA的转录起始受到抑。 （换句话说，无诱导物存在时，阻遏物与操作基因（operator）结合使得结构基因不能正常转录） ！ 当诱导物（乳糖或IPTG）存在，与阻遏物结合时阻遏物从操纵基因上下来，RNA聚合酶可通过启动子和操纵基因正常转录出一条多顺反子mRNA从可翻译得到三种酶。 操纵子控制的重要特性是阻遏物的双重性：它既能阻止转录，又能识别小分子诱导物。 阻遏物有2个结合位点：一个是结合诱导物的，另一个是结合操纵基因的。当诱导物在相应位点结合时，它改变了阻遏蛋白的构象，干扰了另一位点的活性。 这种类型的调控叫变构调控（allosteric control）。 诱导完成一种协同调控（coordinate regulation）：所有的一组基因都一起表达或一起关闭。 mRNA一般总是从5‘端开始转录，所以诱导总是导致β-半乳糖苷酶，Lac透性酶和Lac乙酰转移酶按一定顺序出现。 此多顺反子mRNA的共同转录解释了为什么在诱导物的不同条件下，lacZ、Y、A三个基因的产物总保持同样的当量关系。 诱导触动了“开关”使基因簇表达。诱导物交替变换它们的效应，其它的因子影响了转录和翻译的绝对水平，但三个基因之间的关系事先已被它们的结构所决定了。 Lac操纵子含有lacZ，它编码糖代谢所必须的β-半乳糖苷酶；含有的lac编码透性酶是负责将底物转达运到细胞中。 但操纵子在非诱导状态时，基因尚未表达，也就不存在透性酶。那么诱导物开始怎样进入细胞呢？ 其实在细胞中透过酶等总是以最低量存在的，足以供给底物开始进入之需。操纵子有一个本底水平（basal level）的表达， 即使没有诱导物的存在，它也保持此表达水平（诱导水平的0.1%），而有的诱导物是通过其它的吸收系统进入细胞的。 那IPTG是什么呢？其作用是什么？ IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）是常用的诱导剂。 在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录启动。 当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。 乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为异乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。 异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用与异乳糖相同，是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢且十分稳定，因此两者均可以作为原核表达的诱导剂。 IPTG在作为诱导剂参与原核表达的进程，但其本身并不被消耗，只是化学反应的一个中间物质。 关于原核表达实验，总体来说表达载体和表达菌株的选择可能是至关重要的，很多时候需要多一些思考和尝试。另外适当降低诱导温度，减小IPTG的浓度并延长诱导时间， 或许可以在一定程度上获得更多的可溶性蛋白。总之，原核表达实验虽然步骤简单，但一旦出现状况，需要思考的问题还是蛮多的。先写到这里。 下次有空再写关于原核表达相关的其他内容。 （部分来源于百度百科）