森言森语 最初接触基因克隆和构建载体时，总会遇到这样那样的问题，构建载体作为很多实验的必须步骤，不应该成为阻挡后续实验的障碍。 这是因为通常来说，载体构建相关的问题都过于简单，吃晚饭前花十几二十分钟就关于“正确构建载体需要格外思考的几点问题”简单写一下。 构建载体常出现的问题 1、无法成功克隆到基因 2、基因无法成功连接至载体 3、检测质粒时发现目的基因大小不对 4、检测质粒时发现大小差不多，但测序结果不对 一般，在构建载体时，能遇到的也就这几个问题，如果有其他问题存在也大概与上述四个问题是密切相关的。 需要说的是，如果载体构建出了状况，就不要一味的重复了，一遍不成功，十遍也绝不会对。如果出现例外，那绝对是小概率事件。 那出现上述问题后从哪几方面思考呢？ 1、确保克隆到的基因完全正确： 如果这一步出问题，无非两点原因：引物设计不合理，模板质量不高。 解决方法：多找几个模板同时进行克隆；重新评估引物的合理性和特异性，比如将引物长度增至40 bp左右。 2、关于酶切 酶切其实要求并不十分严格，正常操作下，不论电泳检测是否十分清楚，酶切产物足够连接用量了，没必要纠结。 3、关于酶切位点的选择 这一点很重要。通常很多同学在选择酶切位点时，会习惯性的选择师兄师姐们常用的酶切位点，比如BamHI等，但实际上这样是不行的。 此时需要注意：目的基因中不能出现所选酶切位点，否则，在连接时，残留的酶会对目的基因进行切割，这将直接导致实验的失败。 解决办法：选择酶切位点前，需要检查所选酶切位点是否存在于目的基因中。 小结 总之，如果构建载体时出现问题，就从这几方面一一排除： 引物设计是否合理？ 酶切位点是否选择正确？ 模板质量是否较好？ PCR程序是否设置正确？ 如果以上几点都没问题，那载体构建就不会出问题。 最后，其实不管构建载体还是其他实验，有时做不出来，排除最本质的原因之外，如果正常操作下出现状况， 一定是哪一步做错了或者疏忽了，应该尽量避免一味的机械重复。 还有哪些原因呢？欢迎大家在评论区留言。