Western blot
zhaoguosen / 2021-09-06
说起Western blot，虽是基础实验，但还是让很多研究生头疼，我第一次做WB时的丑图至今历历在目。
图丑点倒也就算了，怕就怕实验快做完了，却没有十足的勇气去显影。生怕忙活了几天又是大白板。
这一类型的实验费时费力，一着不慎，满盘皆输。因此每一步都需要谨慎谨慎再谨慎。
最好是慢慢的想，想清楚了就快快的做。所以有必要对WB有更深一层的理解和认识。
所谓知己知彼，百战不殆！
【进入正题】
1 背景介绍
蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
蛋白质印迹法是由瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所（Friedrich Miescher Institute）的Harry Towbin在1979年提出的。
在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。
现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
2 基本原理
Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体PVDF或NC膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，
且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，
经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
3 主要步骤及说明
第一步：SDS-PAGE电泳
具体原理可见实验技术（3）——电泳（琼脂糖凝胶电泳&蛋白电泳）相关
第二步：转膜
我们把经转膜操作后的NC膜就成为一个印迹（blot），WB中常用的标准固相支持物有硝酸纤维素膜（NC）和聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。
那这两种膜各有什么特点呢？
NC膜：
在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与NC膜发生疏水作用而结合在一起，具有很高的亲和力。
且易于封闭非特异性结合。在非离子去污剂的作用下，结合的蛋白易于被洗脱。当然，根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的NC膜。
PVDF膜：
PVDF膜是一种疏水性聚合物，在水溶液中不会被浸湿，为了在水性缓冲液中使用PVDF膜，
首先需将其浸泡在50%（v/v）的醇溶液中（甲醇、乙醇和异丙醇），浸泡后会活化膜上的正点基团，使其更易与带负电荷的蛋白结合。
同样，根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的PVDF膜。
第三步：封闭
脱脂奶粉或5%BSA溶液处理，以封闭膜上的疏水结合位点。
第四步：孵一抗
这里的一抗是目的蛋白的一抗。孵育时只有目的蛋白才能与一抗结合形成抗原抗体复合物，这样在清洗出去未结合一抗后，只有目的蛋白上结合有一抗。
第五步：孵二抗
这里的二抗是指一抗的抗体。如一抗是鼠一抗，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。
孵育后的带有酶（碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶）标记的二抗（也是俗称的酶标二抗）与一抗结合形成抗体复合物，至此可用来指示一抗的位置，
也即指示了目的蛋白的位置。
那到底什么是抗体呢？
抗体（antibody），又称免疫球蛋白（immunoglobulin，简称Ig），是一种主要由浆细胞分泌，
被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等病原体的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面。
抗体能通过其可变区唯一识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。
蛋白上Y形的其中两个分叉顶端都有一被称为互补位（抗原结合位）的锁状结构，该结构仅针对一种特定的抗原表位。
这就像一把钥匙只能开一把锁一般，使得一种抗体仅能和其中一种抗原相结合。
抗体和抗原的结合完全依靠非共价键的相互作用，这些非共价键的相互作用包括氢键、范德华力、电荷作用和疏水作用。
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抗原结合区（Fab）
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抗原结晶区（Fc）
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蓝色的重链有一个可变区（VH），紧随其后的一个恒定区（CH1），一个枢纽区，以及另两个恒定区（CH2 and CH3）组成
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绿色的轻链包含一个可变区（VL）以及一个恒定区（CL）
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抗原结合点
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枢纽区.
4 常见问题及解决方法
这部分关于WB常见问题及解决方法，经总结之后发现，由于该实验周期长，环节多，
任何一步出问题都可能导致实验失败。所以在这里也没办法一一罗列。
总的来说，从蛋白的制备，转膜，抗体孵育到显影，只要每一步都精细操作，在合理设计实验的情况下都问题不大。
如果遇到千奇百怪的情况，还需从自身出发反思实验细节。
【Reference】